REKOMBINASI MEMBUTUHKAN ENZIM SPESIFIK

REKOMBINASI MEMBUTUHKAN ENZIM SPESIFIK

Proses identifikasi dan memahami enzim-enzim tersebut ditunjukan oleh E. coli. Enzim rekombinasi penting dikode oleh gen recA, B, C, dan D dan oleh gen ruvC. Gen rec B, C, dan D mengkode enzim RecBCD yang dapat menginisiasi rekombinan dengan melepaskan DNA. Protein RecA mempromosikan semua tahapan sentral pada proses: pemasangan dua DNA, formasi Holliday intermediate, dan cabang imigrasi seperti yang dijelaskan berikut. Nukleus tersebut sering disebut resolvases; resolvase E. Coli merupakan protein RuvC. Enzim RecBCD berikatan dengan DNA linear pada salah satu ujung dan menggunakan energi ATP untuk berpindah sepanjang helix, melepaskan DNA didepan dan melepaskannya kembali dibelakang. Pelepasan kembali lebih lambat dari pelepasan sehingga gelembung strand tunggal segera terbentuk dan membesar. Strand tunggal dalam gelembung segera dipotong saat enzim bertemu susunan tertentu yang disebut chi ((5’)GCTGGTGG(3’). Ada sekitar 1000 dari sususan tersebut pada genom E. coli, dan berpengaruh meningkatkan frekuensi rekombinasi pada daerah dimana rekombinasi itu terjadi. Susunan yang meningkatkan frekuensi rekombinasi diidentifikasi pada beberapa organisme.

Protein RecA tidak biasa telibat dalam metabolism DNA karena bentuk aktif enzim ini merupakan perintah, filament helix yang memasang secara kooperatif pada DNA dan mampu melibatkan monomer RecA. Formasi filament ini secara normal terjadi pada DNA strand tunggal seperti yang diproduksi oleh enzim RecBCD. Filamen juga akan terbentuk pada DNA duplex dengan gap strand tunggal, dimana monomer RecA berikataan pertama kali dengan DNA strand tunggal dalam gap dan kemudian kumpulan filament menyelimuti dupleks tetangganya. Paradigma in vitro yang berguna untuk aktivitas rekombinasi filament RecA adalah reaksi yang disebut pertukaran DNA strand. DNA dalam filament dibentangkan dengan DNA duplex kedua, dan strand ditukar antar dua DNA untuk membentuk heteroduplex DNA. Pertukaran yang terjadi antara tingkatan 3 samapi 6 pasangan basa dan berkembang menjadi arah yang unik, 5’_3’ yang berkaitan dengan DNA strand tunggal didalam filament. Reaksi ini dapat melibatkan tiga sampai empat strand, dan pada kasus berikutnya struktur Holliday merupakan intermediate dalam proses. Ketika intermediate Holliday terbentuk, enzim yang terlibat dalam melengkapi rekombinasi termasuk topoisomerase, resolvase, dan nuclease yang lain, DNA polymerase I atau III, dan DNA ligase. Protein RuvC (Mr20.000) pada E. coli menyayat intermediate Holliday banyak detail dari reaksi ini yang dilaksanakan oleh enzim rekombinasi dan koordinasi dari enzim ini belum banyak diketahui. Teknologi DNA rekombinan meliputi beberapa teknik, yaitu:

1. Teknik untuk mengisolasi DNA

2. Teknik untuk memotong DNA

3. Teknik untuk nggabungkan atau menyambungkan DNA

4. Teknik untuk memasukkan DNA rekombinan ke dalam sel hidup sehingga DNA rekombinan tersebut dapat bereplikasi dan dapat diekspresikan dalam sel bakteri lainnya atau sel resipien melalui kontak fisik antara dua sel.